產品簡介:
LDH
Cytotoxicity Assay Kit
乳酸脫氫酶細胞毒性檢測試劑盒
產品信息
產品名稱
|
產品編號
|
規格
|
目錄價(元)
|
促銷價(元)
|
乳酸脫氫酶細胞毒性檢測試劑盒
|
MX3235-500T
|
500T
|
1150
|
970
|
產品描述
乳酸脫氫酶細胞毒性檢測試劑盒(LDH Cytotoxicity Assay Kit),也稱乳酸脫氫酶檢測試劑盒(LDH Assay Kit)或乳酸脫氫酶釋放檢測試劑盒(LDH Release Assay Kit),是一種基于diaphorase催化的INT顯色反應,通過比色法檢測細胞毒性時釋放的乳酸脫氫酶活性或檢測其它樣品中的乳酸脫氫酶活性的試劑盒。
本試劑盒可以用于常規的乳酸脫氫酶活性的檢測,更常用于以LDH釋放為指標的細胞毒性檢測。同時,基于細胞總乳酸脫氫酶活性的檢測,本試劑盒也可以用于檢測細胞增殖和細胞毒性檢測。
細胞凋亡或壞死而造成的細胞膜結構的破壞會導致細胞漿內的酶釋放到培養液里,其中包括酶活性較為穩定的乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)。通過檢測從質膜破裂的細胞中釋放到培養液中的LDH的活性,就可以實現對細胞毒性的定量分析。LDH釋放被看做細胞膜完整性的重要指標,并被廣泛用于細胞毒性檢測。LDH釋放被認為是以前使用放射性的51Cr標記細胞,隨后通過51Cr釋放進行細胞膜完整性檢測的安全有效的替代方法。
本試劑盒的基本原理是,在乳酸脫氫酶的作用下,NAD+被還原生成NADH,NADH和INT (2-p-iodophenyl-3-nitrophenyl tetrazolium
chloride)被硫辛酰胺脫氫酶(diaphorase)催化反應生成NAD+和強生色物甲臜(formazan),在490nm波長下產生吸收峰,從而通過比色來定量檢測細胞培養液、細胞裂解液等樣品中乳酸脫氫酶的活性。吸光度與乳酸脫氫酶活性成線性正相關。該酶聯反應原理的示意圖如下:
產品組分
組分編號
|
組分名稱
|
規格
|
保存方法
|
MX3235-A
|
LDH釋放試劑
|
7.5ml
|
-20℃保存
|
MX3235-B
|
乳酸溶液
|
10ml
|
-20℃保存
|
MX3235-C
|
酶溶液
|
5ml×2
|
-20℃保存,降低反復凍融次數
|
MX3235-D
|
INT溶液(10X)
|
1ml
|
-20℃避光保存
|
MX3235-E
|
INT稀釋液
|
10ml
|
-20℃保存
|
保存與運輸方法
保存:-20℃避光保存,1年有效。
運輸:冰袋運輸。
注意事項
1)
冷凍會使樣品中部分乳酸脫氫酶失活,4℃可放置2-3天。建議樣品準備好后盡量當天完成測定。
2)
如果檢測細胞培養液中的乳酸脫氫酶,由于血清含有乳酸脫氫酶,建議血清的使用濃度不要超過1%,并最好使用熱滅活血清。如果一定需要使用10%血清,在檢測時一定要設置沒有細胞,但加入了相同體積培養液的對照孔,以用于消除背景。
3)
細胞過度生長、密度過高、離心速度過大、培養箱內外溫差過大,都會造成細胞釋放乳酸脫氫酶增加。
4)
如果希望進行乳酸脫氫酶活性的絕對定量,用戶需自備乳酸脫氫酶標準品。
5)
為了您的安全和健康,請穿實驗服并戴一次性手套操作。
使用方法
一、樣本的準備
1. LDH釋放檢測
1.1) 根據細胞的大小和生長速度將適量細胞接種到96孔細胞培養板中,使待檢測時細胞密度不超過80-90%滿。
1.2)吸去培養液,用PBS液洗滌一次。換新鮮培養液(推薦使用含1%血清的低血清培養液或適當的無血清培養液),將各培養孔分成如下幾組:包括無細胞的培養
液孔(背景空白對照孔),未經藥物處理的對照細胞孔(樣品對照孔),未經藥物處理的用于后續裂解的細胞孔(樣品最大酶活性對照孔),以及藥物處理的細胞 孔(藥物處理樣品孔),并做好標記。按照實驗需要給予適當藥物處理(如加入0-10μl左右特定的藥物刺激,可設置不同濃度,不同處理時間,對照孔中需加
入適當的藥物溶劑對照),繼續按常規培養。到預定的檢測時間點前1小時,從細胞培養箱里取出細胞培養板,在“樣品最大酶活性對照孔”中加入試劑盒提供
的LDH釋放試劑,加入量為原有培養液體積的10%。加入LDH釋放試劑后,反復吹打數次混勻,然后繼續在細胞培養箱中孵育。
1.3)到達預定時間后,將細胞培養板用多孔板離心機400g離心5min。分別取各孔的上清液120μl,加入到一新的96孔板相應孔中,隨即進行樣品測定。
2. 細胞內總LDH的檢測
2.1)
細胞毒性檢測:根據細胞的大小和生長速度將適量細胞接種到96孔細胞培養孔板中,使待檢測時細胞密度不超過80-90%滿。加入不同藥物進行處理,并設
置適當對照。藥物刺激完畢后,將細胞培養板用多孔板離心機400g離心5min。盡量吸除上清,加入150μl用PBS稀釋了10倍的試劑盒提供的LDH釋放試劑(10體積PBS中加入1體積LDH釋放試劑并混勻),適當搖晃培養板混勻,然后繼續在細胞培養箱中孵育1小時。隨后將細胞培養板用多孔板離心機400g離心5min。分 別取各孔的上清液120μl,加入到一新的96孔板相應孔中,隨即進行樣品測定。
2.2) .細胞增殖檢測:根據細胞的大小和生長速度將適量細胞接種到96孔細胞培養孔板中,使促進細胞增殖的藥物刺激后細胞不超過80-90%滿為宜。使用不同的 藥物刺激細胞,并設置適當對照。藥物刺激完畢后,將細胞培養板用多孔板離心機400g離心5min。盡量吸除上清,加入150μl用PBS稀釋了10倍的試劑盒提供
的LDH釋放試劑(10體積PBS中加入1體積LDH釋放試劑并混勻),適當搖晃混勻胞,然后繼續在細培養箱中孵育1小時。隨后將細胞培養板用多孔板離心機400g離 心5min。分別取各孔上清液120μl,加入到一新的96孔板相應孔中,隨即進行樣品測定。
注:LDH釋放檢測更加常用一些,細胞內總LDH檢測通??梢允褂肕TT、WST-1或CCK-8等方法替代。
二、試劑盒的準備
1)
INT溶液(1X)的配置:根據所需的INT溶液(1X)的量,取適量INT溶液(10X)用INT稀釋液稀釋至1X。例如,取20μl INT溶液(10X),加入180μl INT稀釋液
,混勻后即配置為200μl INT溶液(1X)。INT溶液(1X)宜現配現用,配置后4℃保存可于當天使用,不宜配置后凍存。
2) LDH檢測工作液的配制:根據待測定的樣品數(含對照),參考下表在臨檢測前新鮮配制適量的檢測工作液。
注意:LDH檢測工作液必須現配現用,配制和使用過程中均要注意適當避光。
檢測次數
|
1次
|
10次
|
20次
|
50次
|
乳酸溶液
|
20μl
|
200μl
|
400μl
|
1ml
|
INT溶液(1X)
|
20μl
|
200μl
|
400μl
|
1ml
|
酶溶液
|
20μl
|
200μl
|
400μl
|
1ml
|
總體積
|
60μl
|
600μl
|
1.2 ml
|
3ml
|
3)
(選做)如果希望進行LDH酶活性的絕對定量,需自備LDH標準品,并新鮮配制不同濃度LDH標準品,如10mU/ml、5mU/ml、2.5mU/ml、1.25mU/ml、0.65mU/ml、0 mU/ml。
三、樣品的測定
1)
各孔分別加入60μl LDH檢測工作液。
2)混勻,室溫(約25℃)避光孵育30min(可用鋁箔包裹后置于水平搖床或側擺搖床上緩慢搖動)。然后在490nm處測定吸光度。使用600nm或大于600nm的任一 波長作為參考波長進行雙波長測定。
3)計算(測得的各組吸光度均應減去背景空白對照孔吸光度)
4)細胞毒性或死亡率(%)=(處理樣品吸光度-樣品對照孔吸光度) / (細胞最大酶活性的吸光度-樣品對照孔吸光度)×100
5)可繪制細胞毒性曲線:縱坐標為實際吸光度,橫坐標為藥物濃度;據此可計算該藥物作用特定時間的半致死劑量LD50。
附錄I:
可同時測定一已知濃度的LDH酶標準品對應的吸光度值,參考以下公式粗略計算出樣品中LDH酶活力:
待測樣品中LDH活力單位(mU/ml)=
(樣品孔吸光度-背景空白對照孔吸光度) / (標準管吸光度-標準空白管吸光度)×標準品濃度(mU/ml);
根據計算結果可以比較不同樣品處理組間有無統計學差異等。
附錄II:
若需準確計算出LDH酶活性的絕對活性,可通過一系列LDH標準品及相應測得的吸光度值繪制標準曲線,通過標準曲線相應公式計算出樣品中LDH的酶活性。
各孔數值減去空白對照后,以檢測的吸光度(OD490)為縱坐標,LDH酶活力(mU)為橫坐標,繪制LDH標準曲線。同時計算出該趨勢線的公式。
A490nm=k×LDH酶活力單位(mU)+b,通過Excel等軟件計算出趨勢線的斜率k和截距b。
根據上述公式計算樣品中LDH活力。
樣品實際吸光度(OD490)=樣品孔測得的吸光度-背景空白對照孔吸光度
檢測體系中LDH酶活力單位(mU)=(OD490-b)/k
樣品中LDH酶活力(mU/ml)=檢測體系中LDH酶活力單位(mU )/檢測樣品體積
相關產品
編號
|
產品名稱
|
規格
|
MX3001-5G
|
Trypan Blue臺盼藍
|
5g
|
MX3002-50ML
|
0.4% Trypan Blue Solution 0.4%臺盼藍染色液
|
50ml
|
MX3003-100T
|
臺盼藍染色細胞存活率檢測試劑盒
|
100T
|
MX3004-250MG
|
MTT噻唑蘭
|
250mg
|
MX3005-500T
|
MTT細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒
|
500T
|
MX3006-5ML
|
Alamar Blue阿爾瑪藍細胞增殖及毒性檢測試劑
|
5ml (500T)
|
MX3007-100T
|
WST-1細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒
|
100T
|
MX3008-1ML
|
Cell Counting Kit (CCK-8) CCK-8細胞增殖及毒性檢測試劑
|
1ml (100T)
|
|